Был установлен оптимальный состав реакционной смеси для нового фермента. На рис. 2 приведены результаты изучения влияния концентрации КС1 и NaCl на степень гидролиза ДНК фага Т7 эндонуклеазой N.BstSE. Из рис. 2 следует, что предпочтительным является использование в реакционном буфере ионов калия, а не натрия, наибольшую активность фермент проявляет при концентрации КСl 100-200 мМ. Подобным же образом отдельно провели оптимизацию состава инкубационной смеси по концентрации MgCl2, рН и температуре проведения реакции. Также выяснили, что из всех возможных кофакторов, проверенных нами (ATP, S-аденозилметионин, Mg2+, Mn2+), фермент нуждается только в ионах Mg2+, а замена их на Mn2+ значительно снижает скорость реакции (данные не приведены). Максимальная активность фермента обнаружена в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, рН 8.5, 10 мМ MgCl2, 150 мМ КС1 и 1 мМ дитиотреитол при температуре 55oС.
Выход очищенного фермента составил около 1000 ед. акт. на 1 г исходной биомассы. Препарат N.BstSE, проверенный по стандартным тестам [3], не содержал примесей неспецифических нуклеаз и/или фосфатаз.
Рис. 1. Электрофоретическое разделение продуктов гидролиза ДНК эндонуклеазой N.BstSE. а - Вирусные ДНК: фаг Т7 (1), аденовирус типа 2 (2) и фаг лямбда (3); b - плазмидные ДНК: pBR322 (1, 2), pUC19 (3, 4). Контрольные образцы ДНК, не обработанные ферментом (1, 3). Указаны релаксированная (R) и сверхспирализованная (S) формы плазмид. М -маркер длин фрагментов ДНК (ДНК лямбда + HindIII). Видимые полосы соответствуют фрагментам ДНК длиной 23130, 9416, 6557, 4361, 2322 и 2027 п.н.
В ходе работ по изучению бактериальных систем рестрикции-модификации было установлено, что штамм В. stearothermophilus SE-589 продуцирует фермент, специфически фрагментирующий некоторые из часто используемых субстратных ДНК (рис. 1а). Эта эндонуклеаза, получившая название N.BstSE, была выделена с помощью трех стадий колоночной хроматографии.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали препараты ДНК, олигонуклеотиды, эндонуклеазы рестрикции и другие ферменты производства НПО "СибЭнзим".
Для разделения продуктов ферментативного гидролиза радиоактивно меченных олигонуклеотидов применяли электрофорез в 20%-ном полиакриламидном геле, содержащем 7 М мочевину.
За единицу активности принимали количество фермента, необходимого для выявляемой электрофоретически полной фрагментации 1 мкг ДНК фага Т7 в реакционном объеме 50 мкл за 1 ч.
Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 1%-ном агарозном геле в ТАЕ-буфере (50 мМ Трис-Ас, рН 8.0, 20 мМ NaAc, 2 мМ EDTA). После окрашивания бромистым этидием гель фотографировали в УФ-свете.
Препарат сайт-специфической никазы N.BstSE был получен с помощью трех последовательных этапов хроматографичсской очистки на фосфоцеллюлозе Р11, DEAE-целлюлозе DE52 ("Whatman", Великобритания) и гепарин-сефарозе ("Sigma", США). При элюции применяли 0.2-1.0 М линейный градиент концентрации КС1 в буфере А. Для выявления активности фермента во фракциях 1 мкл элюата добавляли к 50 мкл инкубационной смеси, содержащей 20 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 10 мМ MgCl2, 100 мМ NaCl, 1 мМ дитиотреитол, 20 мкг/мл ДНК фага Т7. Реакцию проводили при 50oС. Через 30 мин к смеси добавляли 5 мкл раствора, содержащего 100 мМ EDTA, 40% сахарозы и 0.05% бромфенолового синего.
последним импульсом к суспензии добавляли ингибитор протеаз - диизопропил-фторфосфат ("Merck", Германия) - до 0.001% и тритон Х-100 - до 0.1%. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 18000 об/мин.
Полученную биомассу суспендировали в буфере А, содержащем 10 мМ Трис-НС1, рН 7.5, 5 мМ EDTA, 1 мМ дитиотреитол и 200 мМ КС1. Клетки разрушали на ультразвуковом дезинтеграторе "Soniprep 150" ("MSE", Великобритания) в ледяной бане пятью импульсами длительностью по 45 с с интервалами 1 мин. Перед
Штамм В. stearothermophilus SE-589 из коллекции термофильных микроорганизмов ТОО "СибЭнзим" выращивали на питательной среде Лурия (10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г/л NaCl, pH 7.6) при температуре 500С и интенсивной аэрации среды. При достижении культурой поздней логарифмической стадии роста клетки осаждали путем центрифугирования.
УСЛОВИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Нами обнаружен новый фермент - сайт-специфическая никаза, названная N.BstSE, близкая по свойствам к эндонуклеазам рестрикции типа II, но, в отличие от них, расщепляющая только одну из цепей двухцепочечной ДНК. Выделенная нами никаза является строго специфичным ферментом и может быть использована в генно-инженерных работах.
На сегодняшний день известно несколько типов ферментов, узнающих в ДНК определенные последовательности нуклеотидов и расщепляющих фосфодиэфирные связи в строго определенных позициях по отношению к сайту узнавания. К ним относятся прежде всего эндонуклеазы рестрикции типа II из прокариотических организмов и интрон-кодируемые эндонуклеазы эукариот и архебактерий [1]. В значительно меньшей степени выражена специфичность у топоизомераз, интеграз и ряда других ферментов, принимающих участие в рекомбинации |2].
Изучение свойств этого фермента, названного N.BstSE, свидетельствует о его вероятном родстве с эндонуклеазами рестрикции типа II.
Библиотека научных трудов :: Новые ферменты Молекулярная Биология Том 30 1996 Вып. 6 страницы : N.BstSE - сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589 , О.А. Беличенко, A.B. Шевченко, C.X. Дегтярев * - автор для переписки Из штамма Bacillus stearothermophilus SE-589 выделена сайт-специфическая никаза, узнающая и гидролизующая последовательность ДНК в указанном стрелкой положении:
N.BstSE - сайт-специфическая никаза из Bacillus stearothermophilus SE-589
Комментариев нет:
Отправить комментарий